Фаги, бактерии и ламаркизм
«В сущности я буду вам рассказывать про один и тот же эксперимент, — сказал в начале своей публичной лекции в Политехническом музее 25 марта 2010 г. доктор биологических наук, заведующий лабораторией Института молекулярной генетики РАН, профессор Университета Ратгерса Константин Северинов. — За последние 70 лет его ставили минимум три раза, все три раза получали разные результаты, и все результаты были правильными».
Присказка о приобретенных признаках
С тех пор, как наука предположила, что виды могут изменяться, ей пришлось отвечать на вопрос: каким образом возникает удивительная приспособленность живых организмов к условиям их жизни?
По мнению автора первой цельной эволюционной теории, знаменитого французского зоолога Жана Батиста Ламарка, все дело в изначальной способности живых организмов изменять в некоторых пределах свои черты сообразно требованиям среды. Все знают, что у человека, регулярно поднимающего тяжести, увеличиваются мышцы; сосна, затененная соседними деревьями, начинает тянуться вверх, а хамелеон и осьминог меняют цвет своих покровов в соответствии с окружающим фоном. Остается только предположить, что эти изменения передаются потомству, накапливаясь в ряду поколений.
Впрочем, сам Ламарк считал, что наследование индивидуальных достижений лишь модифицирует действие главной движущей силы эволюции — стремления к прогрессу. Однако по иронии судьбы словом «ламаркизм» стало зваться именно представление о наследовании адаптивных изменений, приобретенных в течение жизни.
Полвека спустя Чарлз Дарвин предложил другое решение проблемы приспособленности. Материалом для эволюции служат случайные и ненаправленные наследственные изменения. Те из них, которые способствуют выживанию и размножению своих обладателей, со временем распространяются в популяции и становятся исходным рубежом для следующего шага. Окружающая среда не диктует организму, в какую сторону ему меняться, — она лишь благоприятствует носителям одних изменений больше, чем обладателям других.
Поначалу почти все эволюционно настроенные биологи признавали действие в природе обоих механизмов. Возможности наследования адаптивных изменений не отрицал и сам Дарвин — указав лишь, что некоторые адаптации не могут быть объяснены таким образом. Однако вскоре Август Вейсман выступил с утверждением, что приобретенные в течение жизни признаки не наследуются вовсе. Опровергнуть его (а этого хотелось многим) можно было только одним способом — доказав реальность этого феномена.
Поиски его уступают разве что поискам философского камня и вечного двигателя. Не раз и не два энтузиасты сообщали об обнаружении бесспорных доказательств, но всякий раз скептики находили либо методологические пороки (а то и прямые фальсификации) в самом эксперименте, либо альтернативные объяснения его результатов. Наследование приобретенных признаков постепенно превращалось из «несомненного» в «весьма вероятное», затем в «возможное», «предполагаемое некоторыми авторами» и, наконец, в «не обнаруженное, несмотря на настойчивые поиски». В микробиологии спор дарвиновской и ламарковской моделей затянулся до 1940-х годов и завершился знаменитым опытом — первым из тех, о которых рассказал профессор Северинов.
По свидетельству дисперсии
Микробиологические опыты хороши тем, что сроки эволюции тут измеряются сутками, а вся эволюционирующая популяция вместе с окружающей средой помещается в одной пробирке или чашке Петри. И одним из факторов среды, приспосабливаться к которым приходилось бактериям, были паразитирующие на них вирусы — фаги. Заражение фагами приводило к массовой гибели бактерий, но, если их было достаточно много, среди них обязательно находилась клетка, невосприимчивая (резистентная) к фагу. Она и ее потомки преспокойно росли и размножались на питательной среде с фагом, образуя на поверхности видимую невооруженным глазом колонию.
В 1943 г. Макс Дельбрюк и Сальваторе Луриа решили проверить, как возникает резистентность — по Ламарку или по Дарвину. В первом случае адаптивные изменения в геноме бактерии должно вызывать именно воздействие фага -а значит, происходить они могут только в его присутствии. И если размножить бактериальный штамм во многих пробирках, а потом из каждой сделать посев на среду с фагом, то число колоний устойчивых бактерий в каждой чашке Петри будет величиной одного порядка.
Если же эволюция идет по Дарвину, то мутации, придающие бактерии устойчивость, возникают независимо от присутствия фага. В одной пробирке нужная мутация произошла десять поколений назад, в другой — пять, а в третьей — только что. Тогда в посеве из первой пробирки устойчивых клеток окажется больше тысячи, из второй — 32, а из третьей — одна-единственная. Строгие расчеты показывают: при адаптации по Ламарку дисперсия (мера отклонения от среднего) числа устойчивых клеток должна равняться их среднему числу, при адаптации по Дарвину — многократно превышать среднее.
Дельбрюк и Луриа поставили свой опыт на бактериях Escherichia coli (кишечной палочке) и фагах Т1. Позднее он был повторен множество раз с разными фагами, а также антибиотиками и другими повреждающими агентами. Результаты были однозначны: дисперсия всегда многократно превышала среднюю величину. Бактерии приспосабливались по Дарвину.
Спустя несколько лет супруги Джошуа и Эстер Ледерберг показали то же самое, что называется, «на пальцах». Они высевали множество бактерий на обычной питательной среде, а затем специальной бархатной подушечкой переносили отпечаток всех колоний на среду с фагом. Если там что-то вырастало (а рано или поздно такое случалось), то можно было точно определить, из какой колонии взялись устойчивые бактерии. И всякий раз оказывалось, что исходная колония тоже устойчива к фагу — с которым никогда в жизни не сталкивалась!
Вопрос был закрыт на многие десятилетия. Но, как оказалось, не навсегда.
Голод научит
Если Дельбрюк и Луриа травили кишечную палочку смертоносными фагами, то профессор Гарвардской медицинской школы Джон Кернс морил ее голодом. Для опытов был выбран мутантный штамм lac-, у которого был поврежден ген фермента лактазы, расщепляющего молочный сахар — лактозу. Множество бактерий этого штамма высевалось на среду, единственным питательным веществом в которой была именно лактоза.
В каждой чашке Петри находилось несколько клеток, у которых произошла обратная мутация и ген восстановил свою активность. Они успешно росли и размножались, давая начало видимым невооруженным глазом колониям. Но и основная масса высеянных бактерий не погибала: они проходили через два-три деления, а затем переставали размножаться и ограничивали до предела процессы жизнедеятельности.
Если через сутки после посева в каждой чашке вырастало всего несколько колоний, то на следующий день к ним добавлялось еще несколько, потом еще… Число колоний, способных расщеплять лактозу, росло прямо пропорционально времени с момента посева на селективную среду. Что точно соответствовало ламарковской модели — длительное действие фактора, к которому надо приспосабливаться, вызывало адекватные изменения в геноме.
Статья Кернса и его сотрудников, опубликованная в 1988 г. в авторитетнейшем журнале Nature, наделала много шуму. Потребовалось длительное масштабное исследование, чтобы разобраться в механизме обнаруженного феномена.
Оказалось, что у использованного Кернсом штамма ген лактазы был выведен из строя не до конца: мутантный фермент все-таки мог расщеплять молочный сахар, но его активность составляла около 2% от нормальной. При таком скудном рационе ни о каком делении, конечно, не могло быть и речи. Но бактерии применяли фирменное ноу-хау — амплификацию. С гена, чьего белка клетке остро не хватает, снимается несколько копий, которые тут же встраиваются в геном. А, скажем, 6 экземпляров мутантного гена — это уже целых 12% нормальной ферментативной активности, достаточно, чтобы потихонечку размножаться. Между тем, еще до опытов Кернса биологи знали, что в неблагоприятных условиях частота мутаций в бактериальных клетках резко возрастает: при стрессе в клетке работает альтернативная ДНК-полимераза, делающая гораздо больше ошибок, чем «штатная». И рано или поздно среди этих ошибок оказывается спасительная — обратная мутация, восстанавливающая нормальную активность фермента.
Таким образом, и этот случай в конечном счете свелся к дарвиновской модели: факторы среды не определяли направление мутаций, а лишь увеличивали их частоту и отбирали удачные варианты.
И все-таки они наследуются!
Филипп Хорват и Родольф Баррангу были сотрудниками компании Danisco — производителя пищевых ингредиентов и культур-заквасок. В последних широко использовался микроб Streptococcus thermophilics, сбраживающий лактозу в молочную кислоту. Слабым местом этого микроба была чувствительность к фагам: случайное заражение могло привести к массовой гибели стрептококков на всем предприятии. Однако и у стрептококка регулярно возникали штаммы, устойчивые к фагам. Задачей Хорвата и Баррангу было выяснить механизм этой устойчивости.
К моменту начала их работы уже было известно, что у стрептококка (в отличие от кишечной палочки) ключевую роль в защите от фагов играет так называемая система CRISPR/Cas. Ядром его является локус CRISPR — участок генома, где короткие (2347 пар) цепочки одинаковых последовательностей нуклеотидов правильно чередуются с участками, почти столь же короткими (21-72 пары), но уникальными -так называемыми спейсерами.
Число спейсеров и разделяющих их повторов в разных клетках различно и может достигать нескольких сотен, но обычно их меньше 50. Рядом с локусом CRISPR лежит обширная область Cas, объединяющая ряд обычных структурных генов, кодирующих различные белки — нуклеазы, полимеразы, нуклеотид-связывающие белки и т.д.
Заразив стрептококки фагом Т1 и выделив устойчивые клетки, Хорват и Баррангу сравнили их локус CRISPR с аналогичным локусом исходного штамма. Оказалось, что у выживших стрептококков этот локус вырос на одну или несколько пар «повтор — спейсер». Причем «текст» нового спейсера всякий раз точно совпадал с каким-нибудь из участков ДНК… того самого фага, устойчивость к которому приобреталась. Чтобы убедиться в неслучайности этого совпадения, ученые методами генной инженерии вставили в локус CRISPR неустойчивого стрептококка искусственный спейсер из ДНК фага. Измененная таким образом клетка оказалась устойчивой к фагу, с которым никогда не сталкивалась.
Дальнейшие исследования позволили реконструировать механизм «бактериального иммунитета». При вторжении фага шанс на спасение получают те клетки, которые успевают вырезать из ДНК агрессора кусочек и вставить его в свой CRISPR, дополнив стандартным повтором. Считанную со всего локуса РНК нарезают на короткие кусочки: две половинки повтора по бокам и спейсер между ними. Поскольку новый спейсер — копия какого-то участка ДНК фага, считанная с него РНК прочно и избирательно связывается с этим участком. И по этой метке Cas-белки опознают и уничтожают всю вирусную ДНК. (Кстати, первоначальное «взятие пробы» чуждой ДНК, интеграцию ее в локус CRISPR, нарезку считанной с этого локуса РНК на функциональные фрагменты и т. д. тоже делают Cas-белки, только другие.) И отныне данный фаг никогда не сможет заразить клетки данного штамма — по крайней мере пока не изменит тот участок своего генома, который бактерия ввела в свою «антивирусную библиотеку».
Получается, что запись в геном, обеспечивающую адаптацию к новому фактору среды (фагу), вносит сам этот фактор. И в дальнейшем эта адаптация наследуется всеми потомками приобретшей ее бактерии. Как и постулировал Ламарк.
При этом система CRISPR/Cas -не такая уж экзотика: ею обладают почти все археи (наиболее древние безъядерные организмы, выделяемые ныне в особое царство живых существ) и около 40% изученных бактерий. Правда, у кишечной палочки ее нет — что и позволило Дельбрюку и Луриа доказать дарвиновский механизм адаптации бактерий.
Профессор Северинов делает из этого вывод, что общих принципов, универсальных для всех случаев, в биологии нет и что дальнейшее противопоставление моделей Дарвина и Ламарка лишено смысла. Тем не менее, он согласен, что данный механизм может обеспечить один-единственный тип адаптации — нейтрализацию повреждающего агента, причем непременно биологической природы. Чтобы информация из окружающей среды могла быть прямо внесена в геном, нужно, чтобы она уже была записана на языке генома.
Таким образом, ламарковское наследование иммунитета у бактерий оказывается исключением, которое подтверждает правило: отбор случайных изменений — единственный способ создать новую генетическую информацию.
Борис Жуков
Видеозапись и расшифровку лекции К. Северинова
см. на сайте «Полит.ру» www.polit.ru/lectures/
Обсудить в ЖЖ-сообществе trv_science_ru.