ДНК, выделенная из экспонатов Зоологического музея МГУ, помогает биологам находить ответы на загадки систематики и эволюции животного мира.
Коллекции животных и растений естественнонаучных музеев знакомят посетителей с бесконечным разнообразием живого мира, а для науки хранят это разнообразие экземпляров, собранных натуралистами в течение веков. Причем в музейных экспонатах, заспиртованных, заформалиненных и высушенных в виде тушек и чучел, сохранен не только внешний облик живущих или уже не живущих на планете существ. В них законсервирована информация, которая может рассказать о родственных связях с другими организмами и, следовательно, об их эволюции. Носитель этой информации — ДНК. Нужно только уметь ее прочитать. Сегодня, когда молекулярно-генетические методы прочно вошли в практику полевых зоологов, они используются и в музеях. При всех крупных музеях естественной истории в мире имеются лаборатории генетического анализа, и в них исследуется богатейший материал, за которым и ходить-то никуда не надо — вот он, под рукой. С помощью молекулярной генетики музейные экспонаты в информационном смысле «оживают». И музеи выходят на новый уровень научных исследований — возможность обращения к генетике радикально расширяет использование их коллекций как источника получения новых знаний.
Такая лаборатория теперь есть и в Зоологическом музее МГУ на Большой Никитской. Она начала работать в 2016 году, когда музей отметил свое 225-летие. Называется она Лабораторией исторической ДНК. Слово «исторической» не должно вводить в заблуждение — здесь работают с ДНК животных, живших в исторический период, образцы которых собраны специалистами. Это название подчеркивает возраст музейных экспонатов — им от десятков до пары сотен лет, но не тысячи лет (тогда речь идет уже о палеоДНК, или древней ДНК). Но из образцов «исторического» возраста выделить ДНК гораздо труднее, чем из свежих. Прежде всего нужно обеспечить высокую степень стерильности, чтобы избежать контаминации, проще говоря— загрязнения.
— Готовить лабораторию мы начали еще в 2014 году, — рассказывает канд. биол. наук Евгения Соловьёва, которая руководит лабораторией и работает в ней практически в одиночку (рис. 1). — Было непросто выбрать подходящее помещение в старом здании музея, потом надо было сделать ремонт, покрыть стены специальной краской, на которой не оседает пыль, установить специальную вентиляцию с фильтрами.
Лабораторию надо было оснастить оборудованием, и тут, очень кстати, МГУ получил большой грант на разработку научных основ создания биобанка–депозитария живых систем. Одна из главных задач проекта состояла в том, чтобы провести инвентаризацию, оцифровку и введение в научный оборот многочисленных и разнообразных коллекций, хранящихся в МГУ. На средства проекта сотрудники Зоомузея смогли закупить всё необходимое для работы — ламинарные боксы (рис. 2), термостаты, центрифуги, амплификатор и пр. Навыкам работы с древней ДНК Евгения обучалась на стажировке в Музее естественной истории Стокгольма, в лаборатории, где исследуют ДНК мамонтов, шерстистых носорогов и других животных, исчезнувших с нашей планеты относительно недавно.
С 2016 года лаборатория в Зоомузее начала проводить исследования и решать биологические задачи, которых у зоологов накопилось изрядно.
— В основном мы работаем по запросам коллег, которые занимаются разными группами животных, — рассказывает Евгения Соловьёва, — это и птицы, и беспозвоночные, и пресмыкающиеся, и млекопитающие. Коллеги приходят ко мне с разными задачами. Например, нужно сравнить данные по свежим сборам с типовым экземпляром того же вида в музейной коллекции. Иногда по данному виду есть только музейные образцы, и надо сравнить экземпляры, собранные в разных географических точках. Я выделяю ДНК из материалов разного типа: это могут быть спиртовые пробы, кости, фрагменты тушек.
По пути в лабораторию мы с Евгенией пересекаем исторические интерьеры экспозиционных залов музея с колоннами, галереями и мостиками под потолком, минуем застывших в витринах зверей, птиц и прочих тварей, некоторые из которых ждут своей очереди на генетическое тестирование. Помещение лаборатории, очень маленькое, состоит из трех отсеков. В первом мы переодеваемся в стерильные комплекты одноразовой одежды: комбинезон, шлем, бахилы, перчатки, маска. Система вентиляции устроена так, что воздух через фильтры подается под небольшим давлением в самый чистый отсек, а оттуда поступает в менее чистые отсеки. Таким образом, ток воздуха возможен только в одном направлении. В промежуточном отсеке находятся специальные устройства для обработки костного материала — вибрационная мельница и бокс, в котором из кости высверливается нужный фрагмент (обязательно из ее глубоких слоев). В самом чистом отсеке размещается ламинарный бокс и всё необходимое для выделения ДНК. Это самая ответственная часть работы, именно на этом этапе нужно исключить загрязнение. Здесь возникают определенные сложности.
— Иногда в музейных образцах ДНК сохраняется даже хуже, чем в трупах мамонтов из вечной мерзлоты, — говорит Евгения. — Экспонаты долгое время подвергались воздействию света, температуры. Большая проблема — работа с формалинными образцами. ДНК в них проходит химическую модификацию и сильно разрушается. В мире уже есть работы, в которых ДНК успешно выделяли из формалинных образцов, хотя их очень мало. Я попробовала два метода, но пока они не привели к успеху, надо пробовать другие.
После выделения ДНК в ней надо исследовать определенный участок, а для этого его амплифицируют (многократно умножают) методом полимеразной цепной реакции.
— В нашем случае, — уточняет Евгения, — поскольку ДНК потенциально сильно фрагментирована, амплифицируют короткие перекрывающиеся фрагменты ДНК (длиной около 100–200 пар оснований), используя специфические праймеры (короткие цепочки нуклеотидов, обозначающие начало и конец фрагмента). Эти фрагменты затем собирают в единую последовательность изучаемого гена (или генов).
Какой именно участок ДНК интересует исследователей, зависит от задачи. Чаще всего для ее решения нужно посмотреть последовательности одного-двух, иногда большего числа генов. Начинают обычно с генов митохондриальной ДНК, при необходимости переходят на ядерные гены. Для секвенирования (определения последовательности ДНК) материал отправляют в другую лабораторию — «Евроген» в Институте биоорганической химии РАН. Полученный результат сравнивают с открытой онлайновой базой — Генбанком (GenBank).
— По митохондриальной ДНК мы чаще всего работаем с геном первой субъединицы цитохромоксидазы (COI) — он используется для «баркодинга» (генетический «штрих-код», специфичный для каждого вида), и по нему в Генбанке накоплен большой объем информации, — объясняет Соловьёва. — Для некоторых видов мы выбираем гены, исходя из того, по каким из них имеется больше всего данных для сравнения.
Анализируя полученные результаты, исследователи ищут ответы на поставленные вопросы о родственных отношениях изучаемых животных. Для этого сравнивают последовательности ДНК этих животных и близкородственных таксонов и строят филогенетические деревья — графическое отображение эволюционных связей между видами (подвидами, особями и т. п.).
Каждая биологическая задача, решаемая в лаборатории, — это основа для отдельного проекта. За два года в работе было 13 проектов, из которых пять завершены, а результаты четырех уже опубликованы в научных статьях.
Например, в одном из проектов исследовали летучую мышь — нетопыря, хранившегося в музее в единственном экземпляре, для которого не была ясна принадлежность к какой-либо группе.
— Анализ фрагментов двух митохондриальных и одного ядерного гена показал, что он относится к группе восточных нетопырей, ближе к яванскому нетопырю, — говорит Евгения. — Мы анализировали и другие близкие роды из этой трибы, и нам удалось подтвердить, что нетопыри распадаются на группу восточных и группу западных видов, при этом наиболее близкой ветвью к восточным оказался отдельный род — толстопалые нетопыри. А по музейному экземпляру нетопыря мы описали новый подрод.
Самый первый проект, как рассказывает Евгения, был непосредственно связан с ее специальностью — она герпетолог и диссертацию защищала по филогении круглоголовок. На филогенетическом дереве не хватало хентаунской круглоголовки — это ящерица, обитающая в Туркмении (рис. 3). Организовать экспедицию в Туркмению для ее поисков сейчас практически невозможно. Но экземпляр высушенной шкурки круглоголовки хранился в музее. Из него удалось получить данные по трем генам, что позволило дополнить филогенетическое дерево круглоголовок.
Еще один проект, пока не законченный, — анализ ДНК чекана Пржевальского. Эти маленькие птички живут в Китае, в труднодоступных горных регионах. В лаборатории удалось выделить ДНК из тушек, которые были собраны 130–150 лет назад — на сегодня это самый старый из анализируемых образцов (рис. 4). Результаты по митохондриальному гену ND2 сравнили с данными Генбанка и данными других коллег. И оказалось, что генетика в данном случае противоречит морфологии и биоакустике: птицы, которые отличаются по внешнему виду и песне, обладают одинаковой митохондриальной ДНК. Теперь перед учеными стоит задача проверить маркеры ядерной ДНК, чтобы понять, как такое могло получиться. Возможно, между близкими видами чеканов произошла гибридизация, в ходе которой один вид позаимствовал митохондриальный геном у другого вида.
А тем временем появляются новые задачи и новые проекты. Ученые начали работать с тарпаном — вымершим видом дикой лошади. В Зоомузее хранится череп тарпана (рис. 5), ему около 100 лет, вероятно, это был последний тарпан, встреченный в природе. ДНК тарпана специалисты планируют отдать на секвенирование полного генома.
— По тарпану пока нет никаких молекулярных данных, — говорит Соловьёва. — Мы хотим узнать, насколько он отличается от других лошадей и с какими их видами находится в наиболее близком родстве.
Молекулярно-генетическая лаборатория для работы с музейными образцами животных пока единственная в нашей стране. Правда, генетики работают с древней ДНК в Москве и Новосибирске, но у них несколько иные задачи. Такой лаборатории, которая была бы нацелена именно на работу с музейными образцами и на решение с их помощью различных биологических задач, в России больше нет.
— В коллекции Зоологического музея МГУ около 10 млн экземпляров, — рассказывает директор музея, докт. биол. наук Михаил Калякин. — Эта оценка очень приблизительная, так как точно подсчитать мелких беспозвоночных животных невозможно. У нас есть планктонные пробы, пробы бентоса, в каждой из которых тысячи организмов, — как их посчитать? Мы попробовали оценить нашу коллекцию жуков, грубо прикинув число экземпляров в ящиках и ящиков в шкафах, получилось порядка 5 млн. История музея восходит к 1759 году. Но за 260 лет его гигантская коллекция никогда не была в такой степени востребована, как сейчас. Сегодня мы можем, используя образцы из коллекции, перепроверить данные, выявить ошибки и исследовать данные на новом уровне современных технологий. В Лаборатории исторической ДНК мы пытаемся решить сокровенные вопросы систематики, найти ответы на загадки, которые зоологи много лет не могли разгадать. Благодаря появлению у нас этой лаборатории значительная часть музейной коллекции стала доступна для генетического анализа. Пока речь идёт о точечном использовании наиболее важных и интересных экземпляров, но технологии развиваются, и перспективы использования музейных коллекций расширяются.
Надежда Маркина
От редакции ТрВ-Наука: Искренне желаем сотрудникам музея удачи и энергии в этом титаническом труде!