Изучение древних белков

Традиционный образ археолога — обгоревший на раскопках человек, который пользуется лопатой, совочком, а для особых случаев — кисточкой, чтобы очистить от пыли особо хрупкие находки. Однако благодаря развитию химической археологии появились исследователи древностей, одетые в белоснежные халаты, основные инструменты которых — спектрометры. Они изучают обнаруженные на древних артефактах биомолекулы — белки и нуклеиновые кислоты, которые по крупицам дают дополнительную информацию о том, как жили предки человека.

Одним из наиболее эффективных способов получения информации о наших далеких предках, как уже освоивших прямохождение, так и передвигавшихся, еще опираясь на передние конечности, уже давно считается анализ ДНК. Это помимо прочего позволяет отличить друг от друга разные биологические виды. Однако у любого метода есть свои границы применимости. С точки зрения археологии и тем более палеонтологии нуклеиновые кислоты — очень эфемерные улики, которые неизбежно разрушаются со временем. Самые древние образцы ДНК, с которыми приходилось иметь дело исследователям, принадлежат предку современной лошади, и их возраст составляет 560–780 тыс. лет [1].

В отличие от ДНК другие биополимеры, белки, более устойчивы. В настоящее время палеонтологи располагают образцами функциональных белков, возраст которых в три раза больше образцов ДНК-рекордсменов. Недавно удалось изучить белок, выделенный из дентина ископаемого носорога, возраст которого — около 1,77 млн лет [2].

Иногда палеонтологам удается обнаружить и более древние белки; как правило, они относятся к прочным и устойчивым к воздействию окружающей среды структурным белкам. В 2003 году группа исследователей, возглавляемая Мэри Швайцер (Mary Schweitzer) из Университета Северной Каролины, обнаружила скелет T. Rex, возраст которого составляет 68 млн лет¹. Обычно процесс окаменения заменяет все органические вещества неорганическими, оставляя только каменную копию оригинала. Однако когда при транспортировке случайно были сломаны бедренная и большая берцовая кости динозавра, исследователи обнаружили волокнистые и гибкие ткани. Кости рептилии мумифицировались, полное окаменение не про­изошло. Именно это позволило выделить из них структурные белки соединительных тканей, коллагены, которые могут сохраняться в неизменном виде в течение миллионов лет. Сравнение белковых структур с белками ныне существующих биологических видов показало, что коллаген динозавра более близок к белковым последовательностям, характерным для тритонов, цыплят и лягушек, и это соответствует устоявшимся представлениям о том, что современные амфибии, рептилии и птицы — потомки динозавров [3].

Устойчивость древних белков и информация, которую они могут содержать, позволили за последние два десятилетия палеонтологам, археологам и антропологам разработать новые методы анализа белкового материала, обнаруживаемого на местах раскопок. Чаще всего анализировать приходится именно коллаген — он входит в состав кожи мышечных волокон и, что особенно важно для археологов и палеонтологов, в состав костей. Как и в описанном выше случае с динозавром, кости, превращаясь в окаменелости, могут «законсервировать» коллаген и другие белки, сплетенные с ним.

В начале 2000-х годов в Йоркском университете (Великобритания) была разработана методика, которую назвали «масс-спектрометрическая зооархеология» (zooarchaeology by mass spectrometry, или ZooMS), с помощью которой можно идентифицировать биологические виды, изучая коллаген [4]. Суть методики ZooMS в том, что коллаген извлекают из образца, а затем разделяют на более короткие пептидные цепочки с помощью ферментов. Затем эти цепочки изучают с помощью высокоэффективной масс-спектрометрии. Поскольку у различных биологических видов первичная структура белков индивидуальна, результаты масс-спектрометрического анализа позволяют получить сигнатуры, характерные для каждого биологического вида.

Так как коллаген — всего лишь один из множества белков, содержащихся в биологических тканях, и может обеспечить ученых сравнительно умеренной информацией, на протяжении последних десяти лет методы анализа белков в археологических и палеонтологических образцах продолжили совершенствоваться, и сейчас количество белков, доступных для изучения специалистам по химической археологии, значительно выросло.

Получение полезной информации при изучении белков сопряжено с большим количеством трудностей. Те белки, которые сохранились лучше всего, обычно содержатся в минерализованных образцах, защищенных костной тканью или зубной эмалью. Поэтому до разделения и анализа белков приходится проводить процедуру деминерализации, причем очень осторожно, чтобы не повредить белковые образцы. С выделением белка из окаменелости проблемы не заканчиваются — несмотря на то, что белковые цепи устойчивее ДНК, нужно учитывать, что и в процессе «хранения» в окаменелости, и во время работы с ними белки могут разрушаться или изменяться. Прежде всего на строение образцов могут повлиять процессы гидролиза (разрушения белковой цепи на укороченные цепи или отдельные аминокислоты в присутствии воды) и деамидирования (отрыва групп NH2 от остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот). К счастью, все эти изменения в составе белков можно определить с помощью масс-спектрометрии. И, само собой, для работы с ископаемыми белками необходимо придерживаться исключительной стерильности, чтобы не загрязнить объекты исследования современными белками. Для этого и собственная, и лабораторная защитная одежда у химиков-археологов должна быть синтетической — даже хлопковые и льняные ткани, не говоря уже о шелке, шерсти и коже могут стать источником современных белков и пептидов.

Несмотря на все сложности, анализ белков дает специалистам по химической археологии большие возможности — по структуре белка можно реконструировать ДНК организма и понять, к какому биологическому виду он относится. В ряде случаев белки могут рассказать даже больше, чем ДНК.

Недавно немецко-китайская группа исследователей с помощью анализа белков установила, что обнаруженная на Тибетском плато челюсть, возраст которой примерно 160 тыс. лет, принадлежит гоминиду, относящемуся к денисовцам [5]. Денисовцы, или денисовские люди (Homo sapiens denisovan), — вымерший подвид или вид людей, который ранее был известен только по материалам из Денисовой пещеры в Солонешенском районе Алтайского края². Исследователи не смогли выделить из обнаруженной в Тибете челюсти ДНК — разрушению нуклеиновых кислот способствовал и возраст челюсти, и химическая природа окружавших челюсть осадочных пород, — именно поэтому пришлось прибегнуть к анализу белков. Была задействована высокоэффективная жидкостная хроматография, сопряженная с масс-спектрометрией. Этот аналитический метод позволил выделить из сохранившегося под слоем эмали зубов обнаруженной челюсти дентина восемь различных по строению белковых молекул, все из которых относились к семейству коллагенов.

Как отмечает руководитель исследования Фридо Велкер (Frido Welker), благодаря анализу белков не только впервые удалось выяснить, как выглядела нижняя челюсть денисовцев, но и получить материал для сравнения с другими окаменелыми останками гоминидов, обнаруженных на территории Китая, для которых не проводили белковый или генетический анализ. Без анализа этих останков (которых накопилось немало) пока еще нельзя сказать, представителям каких биологических видов они принадлежат.

Установление биологического вида — не единственная область применения изучения белков и химической археологии. Например, химическая археология позволяет определить пищевые пристрастия наших далеких предков. Так, исследователи, работающие под руководством Кристины Уориннер (Christina Warinner), не просто идентифицировали обнаруженные при раскопках ритуальных мест погребения в монгольских степях останки одомашненных животных. Они решили выяснить, с какими целями древние обитатели Евразии три тысячи лет назад выращивали овец, коз и более крупных животных: для молока или только для мяса.

Белки, которые могли бы подсказать, что входило в меню древних людей, стали искать в зубном камне, который мог инкапсулировать белки, попадавшие в организм человека с пищей [6]. При изучении зубного камня девяти людей были обнаружены молочные белки — казеины, а значит, эти люди уже не брезговали коровьим, козьим и овечьим молоком. Вместе с тем геномный анализ показал отсутствие у этих людей мутаций, позволяющих усваивать молоко в зрелом возрасте, т. е. их можно назвать пионерами разведения животных ради молока (по крайней мере на территории современной Монголии).

Таким образом, исследования Уориннер позволяют составить полную картину того, как разведение животных ради молока распространялось по земному шару. Каким образом это можно сделать? Люди, как и все млекопитающие, в детстве питаются молоком, но организм млекопитающих генетически запрограммирован так, что при взрослении перестает вырабатывать лактазу — фермент, способствующий усвоению молочного сахара — лактозы. Это в свою очередь является причиной непереносимости лактозы, что массово наблюдается у этнических групп, которые так и не перешли к практике молочного животноводства. У представителей других этнических групп, тех, что начали выращивать скот не только ради мяса, но и ради молока, со временем закрепилась генетическая мутация, способствовавшая продолжению выработки лактазы и взрослыми особями тоже, по­этому у них появилась способность усваивать молочный сахар в любом возрасте.

С анализом молочных и других белков связано и еще одно интересное направление, которым занимаются специалисты по химической археологии — попытка восстановить «Поваренную книгу первобытного человека». Так, Джессика Хенди (Jessica Hendy) пытается выяснить, что найденные белки могут нам рассказать о способах приготовления пищи древними людьми. Для решения этой задачи приходится сопоставлять современную информацию о химических процессах, протекающих во время приготовления пищи, со строением белков, находимых в зубных камнях и на посуде на местах древних стоянок [7].

Экстракция белков из керамических изделий, найденных при раскопках раннего неолитического сельскохозяйственного поселения в турецком Чатал-Хююк (согласно данным радиоуглеродного анализа, люди жили там около 8 тыс. лет назад), и их последующее изучение позволили найти белковые маркеры злаковых, бобовых, молочных продуктов и мяса.

До того, как появились надежные методы определения строения белков, имеющих архео­логическое значение, исследователи изучали остатки жиров на древней керамике. Липидные маркеры, остававшиеся на посуде, также позволяли делать выводы о пищевых пристрастиях наших предков. Так, анализ жиров дал возможность выяснить, когда в Северной Европе начался процесс сыроварения [8]. Однако изучение белков значительно расширяет наши знания о тех продуктах, которые в доисторические времена содержались в том или ином сосуде. Хенди говорит, что, изучая белки, можно понять, готовили ли в дошедшей до нас через тысячелетия керамической посуде молоко, зерна или бобы. Правда, анализируя только белковый материал, пока еще нельзя сказать, входили ли в состав любимых блюд наших предков молоко, зерновые культуры, бобы и мясо одновременно или же после готовки бобовых посуду, не отмывая, использовали для приготовления молочных блюд. Чтобы выяснить это точнее, нужно более детально изучить слоистые отложения неорганических веществ, сформировавшиеся на этой антикварной посуде.

Аркадий Курамшин,
канд. хим. наук, доцент Химического института КФУ

1. Ludovic Orlando, Aurélien Ginolhac, Guojie Zhang et al. Recalibrating Equus evolution using the genome sequence of an early Middle Pleistocene horse // Nature 2013. — 499, P. 74–78; DOI: 10.1038/nature12323
2. Enrico Cappellini, Frido Welker, Luca Pandolfi, et al. Early Pleistocene enamel proteome sequences from Dmanisi resolve Stephanorhinus phylogeny // Rxiv. — 2018; DOI: 10.1101/407692
3. Mary Higby Schweitzer, Zhiyong Suo, Recep Avci, John M. Asara, Mark A. Allen, Fernando Teran Arce, John R. Horner. Analyses of Soft Tissue from Tyrannosaurus rex suggest the Presence of Protein // Science. — 2007: Vol. 316, Issue 5822, pp. 277–280; DOI: 10.1126/science.1138709
4. Matthew Collins, Mike Buckley, Helen H. Grundy, Jane Thomas-Oates, Julie Wilsona, Nienke van Doorna. ZooMS: the collagen barcode and fingerprints // Spectroscopy Europe. — 2010. — V. 22. — N. — 2. P. 6–10
5. Fahu Chen, Frido Welker, Chuan-Chou Shen et al. A late Middle Pleistocene Denisovan mandible from the Tibetan Plateau // Nature. — 2019, 569, P. 409–412; DOI: 10.1038/s41586-019-1139-x
6. Choongwon Jeong, Shevan Wilkin, Tsend Amgalantugs et al. Bronze Age population dynamics and the rise of dairy pastoralism on the eastern Eurasian steppe // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2018. — V.115. — No 48. — P. E11248–E11255; DOI: 10.1073/pnas.1813608115
7. Jessica Hendy, Andre C. Colonese, Ingmar Franz et al. Ancient proteins from ceramic vessels at Çatalhöyük West reveal the hidden cuisine of early farmers // Nat. Commun. 2018. — 9, Article number: 4064; DOI: 10.1038/s41467-018-06335-6
8. Mélanie Salque, Peter I. Bogucki, Joanna Pyzel. Earliest evidence for cheese making in the sixth millennium BC in northern Europe // Nature. — 2013. — V. 493, P. 522–525; DOI: 10.1038/nature11698

¹ Работы Мэри Швайцер подвергались критике и имели проблемы с воспроизводимостью.
См. напр. trv-science.ru/2008/09/16/park-yurskogo-perioda-otkrytie-otkladyvaetsya. — Прим. ред.

² Про денисовцев см. trv-science.ru/tag/denisovcy/.
Про тибетских денисовцев — trv-science.ru/2019/05/21/tibetskij-denisovec/