Время назад

Челове­чество всегда мечтало найти средство, возвращающее молодость, но до недавнего времени молодильные яблоки, а также зелья и эликсиры, поворачивающие время вспять, существовали только в сказках. В 2012 году Нобелевский комитет присудил премию по физиологии и медици­не двум ученым, которые придума­ли способ, позволяющий не просто скинуть несколько лет, а вернуться в эмбриональное состояние. Правда, работает он не для целого организ­ма, а для отдельных клеток, но этот факт делает открытие Синьи Яманака и Джона Гёрдона куда более зна­чимым, чем изобретение любых омо­лаживающих технологий.

Впасть в детство

Организм человека и любого дру­гого многоклеточного существа состо­ит из клеток, заметно отличающихся друг от друга по внешнему виду и по тем функциям, которые они выпол­няют. Кроме того, одни типы «кирпи­чиков», из которых построена живая ткань, имеют куда большую широту про­филя, чем другие. Часть клеток наше­го организма жестко «заточена» под выполнение какой-то конкретной за­дачи — и вся биохимия и морфология клетки подстраиваются под эту зада­чу. Другие могут выбирать, чем бы им хотелось заняться: после очередного деления потомки таких клеток могут стать, скажем, клетками сосудов, клет­ками крови или еще чем-нибудь.

Клетки, определившиеся со своим предназначением, называют диффе­ренцированными или унипотентными. Для «колеблющихся» используют термин «недифференцированные», причем степень их «потентности» может существенно варьироваться. Самая недифференцированная (если можно так сказать) клетка организма — это оплодотворенная яйцеклетка, из которой развиваются все ткани и ор­ганы. Яйцеклетку, а также ее потом­ков первого-второго поколения на­зывают тотипотентными клетками, и каждая из них способна дать начало целому организму. Именно благода­ря тотипотентности «детей» и «вну­ков» яйцеклетки на свет появляются генетически идентичные, или одно­яйцевые близнецы.

Каждое следующее клеточное по­коление всё больше и больше специа­лизируется. Хотя все клетки эмбриона на ранних стадиях развития способны делиться огромное количество раз и порождать различные типы клеток, стать прародителями всего организма они уже не могут: часть возможных пу­тей для них оказывается закрыта (та­ковы, например, все стволовые клетки человека). По мере того, как количе­ство возможных вариантов будущего уменьшается, клетки становятся сна­чала плюрипотентными, потом мульти— и, наконец, превращаются в жестко детерминированных «работяг», кото­рые сколько бы ни делились, никогда не смогут породить что-то иное, кро­ме копий самих себя. По крайней мере так считалось до недавнего времени.

Последнее предложение предыду­щего абзаца немного грешит против истины: гипотезы о том, что «часы» дифференцированных клеток мож­но заставить идти в обратную сторо­ну, высказывались еще в первой трети XX века. Лауреат Нобелевской премии по физиологии и медицине, немецкий эмбриолог Ганс Шпеман (Hans Spemann) в 1935 году предположил, что ядро специализированной взрослой клетки, попавшее в цитоплазму тотипотентной яйцеклетки, может «пе­редумать» и начать работать так, как будто его геном только что образовал­ся при слиянии материнской и отцов­ской ДНК. Проверить это предсказа­ние, впоследствии оказавшееся абсо­лютно верным, в 30-е годы было тех­нически невозможно, и сам Шпеман называл придуманный им экспери­мент «фантастическим».

Первую попытку «раздифференцировать» клетки по методу Шпемана предприняли в начале 50-х амери­канцы Роберт Бриггс (Robert Briggs) и Томас Кинг (Thomas King). Они научи­лись удалять ядро из оплодотворен­ных яйцеклеток леопардовой лягушки Rana pipiens и подсаживать в опустев­шую цитоплазму ядра недифферен­цированные и дифференцированные клетки амфибий. В первом случае им удалось вырастить из такой гибрид­ной яйцеклетки головастика, а затем и взрослую лягушку, а во второй се­рии опытов икринка погибала. Более того, ученые показали, что чем даль­ше клетка-донор ядра продвинулась по пути дифференцировки, тем рань­ше умирал гибридный эмбрион.

Несмотря на неутешительный ре­зультат, коллеги Бриггса и Кинга сразу оценили значимость методики пере­садки ядра и начали вовсю исполь­зовать ее для разнообразных экспе­риментов. Одним из тех, кто увлекся новым направлением экспериментов, был британский биолог Джон Гёрдон. Он работал с другим видом земноводных — знаменитой шпорцевой ля­гушкой Xenopus laevis, — и после не­скольких лет опытов в 1962 году ему удалось сделать то, что не получилось у Кинга и Бриггса. Гёрдон слегка мо­дифицировал их методику, и, кроме того, он показал, что, если пересажи­вать ядро дифференцированной клет­ки в несколько стадий (т.е. не дора­щивать яйцеклетку с пересаженным ядром до стадии головастика, а до­жидаться первых делений, брать ядра только что образовавшихся клеток и вновь подсаживать их в безъядерную яйцеклетку), процент успеха оказыва­ется заметно выше.

Научная общественность отнес­лась к результатам Гёрдона насторо­женно: только спустя несколько лет после того, как успех ученого смог­ли повторить в других лаборатори­ях, его достижения получили при­знание у коллег.

Снять блок

Опыты Бриггса, Кинга, Гёрдона и дру­гих показали принципиальную воз­можность обратить развитие клетки. Но механизм снятия блокировки, на­кладываемой специализацией, оста­вался неясным. В оплодотворенной яйцеклетке на ядро дифференцирован­ной клетки действует целый коктейль всевозможных факторов, но выделить те из них, которые действительно необходимы для перепрограммирова­ния взрослых клеток, долгое время не представлялось возможным.

В начале нового тысячелетия, по мере совершенствования технологий массового генного анализа, стала вы­рисовываться принципиальная схема эксперимента, который позволил бы вычленить ключевые факторы, управля­ющие клеточной «машиной времени». Анализируя активность генов в эмбри­ональных и взрослых клетках, ученые нашли последовательности, которые работают только в недифференциро­ванном состоянии. Все эти гены коди­ровали белки-регуляторы, называемые транскрипционными факторами (ТФ). Такие белки умеют связываться с ДНК и активировать или, наоборот, блоки­ровать работу специфических генов. На ранних стадиях развития именно ТФ запускают все сложнейшие цепоч­ки реакций, которые в итоге приводят к формированию организма. Проверив, как именно каждый из этих факторов и их всевозможные комбинации вли­яют на судьбу дифференцированных клеток, ученые могли бы вычислить из десятков работающих в эмбриональ­ных клетках ТФ те, которые запуска­ют дедифференцировку. Хотя алгоритм эксперимента очень прост, он требо­вал колоссального количества труда по перебору всех комбинаций ТФ — и предполагаемый объем работ, очевид­но, отпугивал многих исследователей.

Взяться за титанический проект ре­шился японец Синья Яманака (Shinya Yamanaka), получивший медицинское образование, но позже увлекшийся проблемой возвращения взрослым клеткам плюрипотентности. Ученый выбрал 24 ТФ и вставил их в геном клеток кожи (фибробластов) при по­мощи специальных вирусных «пере­носчиков», умеющих встраивать свою последовательность в ДНК клетки-хозяина. На следующей стадии экс­перимента Яманаки высаживал мо­дифицированные фибробласты на чашки Петри и отбирал те клетки, которые утратили специализацию и дедифференцировались. Ученый определял, гены каких ТФ работают в «омолодившихся» клетках, и затем вновь вставлял в ДНК фибробластов гены этих ТФ, каждый раз по одно­му уменьшая их количество. В итоге Яманака отобрал из двух с полови­ной десятков генов четыре, которые запускали дедифференцировку фибробластов. Они называются с-Myc, Oct3/4, Sox2 и Klf4. Полученные та­ким путем тотипотентные клетки Яманака назвал индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (induced pluripotent stem cells — iPS). Работу японского исследователя не­медленно назвали прорывом в моле­кулярной биологии: придуманная Яманакой схема, в отличие от трудоемкого и требовательного метода пересадки ядер, позволяла дедифференцировать лю­бые клетки легко и просто. После выхода статьи япон­ца в журнале Cell в 2006 году количество публика­ций, посвященных дедифференцировке клеток, стало расти с невероятной ско­ростью. Сам Яманака так­же продолжал заниматься этой темой и выполнил еще несколько знаковых экспериментов. В частности, уже на следующий год две группы ученых (одна из них работала под руководством Яманаки) смогли по­лучить iPS человека. А в 2009 году ки­тайские исследователи смогли вырас­тить из созданных по методу Яманаки клеток относительно здоровую мышь.

Сложности

У разработанной японцем методи­ки было два существенных недостатка. Во-первых, один из входящих в «вол­шебную четверку» генов ТФ Яманаки — это онкоген, существенно повышаю­щий вероятность развития опухолей. А во-вторых, сам эксперимент по по­лучению iPS способен превращать нормальную клетку в раковую: не­сущие гены ТФ вирусы могут встра­иваться в любое место генома, и при неудачной «посадке» клетка начина­ет сходить с ума. Колоссальный эн­тузиазм исследователей, взявшихся за перспективную тему, позволил ре­шить обе эти проблемы за несколько лет. Вторую сложность удалось преодолеть, используя сначала другие ви­русные «переносчики», не способные встраиваться в ДНК, а потом и вовсе «голые» фрагменты ДНК, которые те­ряются при последующих клеточных делениях. Проблему с онкогеном Myc удалось решить, слегка изменив состав дедифференцирующего «коктейля». По мере изучения iPS выявлялись и другие сложности. В частности, тща­тельный анализ показал, что iPS — это все-таки не точный аналог тотипотентных эмбриональных клеток. В iPS ак­тивен немного другой набор генов, и, кроме того, образующиеся из них клетки растут медленнее, чем потом­ки «нормальной» яйцеклетки. Причина этих различий скорее всего кроется в эпигенетических маркерах — надгеномных «поправках», которые могут вноситься в ДНК по мере существо­вания клетки и дополнительно ре­гулируют работу генома. У взрослых клеток эпигенетические метки нахо­дятся на других фрагментах ДНК по сравнению с эмбриональными, и, как снять это «клеймо» возраста, ученые пока не знают. Считается, что именно эпигенетика привела к ранней смер­ти овечки Долли — первого млекопи­тающего, клонированного по той же принципиальной схеме, которую ис­пользовал Гёрдон.

В 2008 году создатели овечки Долли Ян Уилмут и Кейт Кемпбелл вместе с Яманакой получили премию Шоу — азиатский аналог Нобелевской премии. Научную общественность немало озадачил тот факт, что Гёрдон остался без этой награды – тем более, что он некоторое время работал вместе с Уилмутом и Кемпбеллом. 

Работы в области перепрограмми­рования клеток очень активно ведутся в лабораториях по всему миру. Пере­оценить значение этих исследований для фундаментальной науки невоз­можно, но перспективы использова­ния iPS огромны и в медицине. Зано­во созданные стволовые клетки можно использовать для получения специа­лизированных клеток, которыми мож­но заменить деградировавшие клетки при таких заболеваниях, как болезнь Альцгеймера или боковой амиотрофический склероз (болезнь, от которой страдает Стивен Хокинг). Кроме того, на iPS, полученных из клеток людей с различными недугами, можно изучать механизмы развития этих патологий и искать методы борьбы с ними. Од­нако на сегодня готовых методик кли­нического использования индуциро­ванных стволовых клеток нет, но если их изучение будет продвигаться теми же темпами, что и сейчас, то на их по­явление можно рассчитывать уже в обозримом будущем.

Ирина Якутенко